Edição 10 - Abril de 2020

A pandemia do SARS-COV-2 no contexto da Ciência em Animais de Laboratório

Desde o começo de Março medidas foram tomadas para conter a expansão do SARS-CoV-2 no Brasil, vírus que começou a ser identificado em Wuhan, na província de Hubei, China (transmitido por reservatórios animais, possivelmente o Pangolim, ou por Morcegos), a partir de vários casos de pacientes com pneumonia em Dezembro de 2019.  A infecção por SARS-CoV-2 tem uma alta taxa de transmissão, pois cada pessoa infectada pode transmitir o vírus para, em média, 2,2 pessoas, o que tornou o vírus capaz de se disseminar rapidamente pelo mundo. Além disso, a infecção evolui rapidamente para o óbito (principalmente de indivíduos mais velhos), o que levou à necessidade de quarentena em uma escala global.

O SARS-CoV-2 faz parte da família Orthocoronavirinae (CoV), vírus zoonóticos emergentes que levam ao aparecimento de novas doenças, como o Vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV, identificado em 2003) e o Vírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV, descoberto em 2012), vírus geneticamente relacionados ao SARS-CoV-2. Já foram realizados vários estudos com o SARS-CoV e o MERS-CoV, principalmente para seu tratamento como, por exemplo, com a Cloroquina, a Ribavirina, o Lopinavir e o Interferon, mas atualmente não existem terapias aprovadas para qualquer coronavírus humano. Os Coronavírus são vírus envelopados de RNA positivo, que possuem as proteínas virais: nucleocapsídeo (N), glicoproteína de membrana (M), proteína do envelope (E), glicoproteína spike (S) de superfície e glicoproteína hemaglutinina-esterase (HE). A HE é uma proteína extremamente importante no estudo do SARS-CoV-2, pois possui propriedades de acetil esterase e de hemaglutinação.

Esses vírus se ligam aos receptores do hospedeiro e penetram em suas células por meio da glicoproteína S. Já se sabe que o receptor humano para o SARS-CoV e SARS-CoV-2 é a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2 ou, como chamado no Brasil ECA2), receptor encontrado em vários tecidos do corpo humano, como pulmão, coração e intestino. Outra característica importante relacionada a esta enzima é que ocorre aumento da expressão do ACE2 nos tecidos do pulmão quando o indivíduo possui outras comorbidades além da infecção pelo SARS-CoV-2.

O SARS-CoV-2 causa a doença chamada de COVID-19. O modo mais importante de transmissão do COVID-19 é a inalação de aerossóis infecciosos, embora também estejam sendo consideradas outras vias como fômites, o que reforça o valor das ações voltadas para biossegurança em todas as etapas da cadeia de transmissão. O período de incubação da doença é de, aproximadamente, 3 a 14 dias. A COVID-19 pode variar desde infecções assintomáticas até doença fatal por pneumonia, o que ocorre, principalmente, em pacientes idosos. Outros sintomas não específicos incluem febre, tosse, congestão nasal, dor de garganta, mialgia (dor nos músculos), dificuldade para respirar, mal-estar e diarréia. Atualmente já se sabe que a perda de olfato e/ou paladar são sintomas especificos da doença. Com o aumento da gravidade, o indivíduo infectado passa a ter maior dificuldade ao respirar e ocorre síndrome do estresse respiratório agudo, o que leva à necessidade de ventilação mecânica em UTI hospitalar. Em alguns casos pode ocorrer pneumonia bacteriana secundária. As crianças, em geral, são assintomáticas ou possuem sintomas clínicos mais leves do que os adultos, com recuperação ocorrendo após 1 a 2 semanas do começo da infecção. Um fator importante na infecção são as comorbidades como diabetes ou doença cardiovasculares e cerebrovasculares que aumentam a severidade da doença tanto em idosos quanto em outras faixas etárias e também a imunossupressão decorrente de patologias ou de tratamento quimioterápico.

Muitas perguntas ainda precisam ser respondidas sobre a infecção e epidemiologia do SARS-CoV-2. Já se sabe, por exemplo, que ocorre uma alteração na resposta imune após a infecção pelo vírus. A infecção causa aumento de neutrófilos, diminuição de linfócitos em pacientes com maior severidade da doença, uma possível supressão da expressão de interferons do tipo I, além da diminuição de linfócitos T auxiliares, supressores e regulatórios. Outro fator que deve ser considerado é o quadro inflamatório intenso que se instala. Atualmente os especialistas o consideram de grande importância na evolução da doença, onde a resposta fisiológica do doente é fundamental. Assim, algumas lacunas ainda faltam ser preenchidas, como a atuação do vírus na fisiologia do hospedeiro, o melhor tratamento ou a melhor vacina para combater essa infecção.

Infelizmente, não temos ainda uma vacina para o vírus ou protocolos aprovados para o tratamento em larga escala, mas como nos encontramos em meio a uma pandemia, alguns procedimentos estão sendo avaliados com grande rapidez. Alguns já se encontram na fase clínica, sendo examinada a sua eficácia diretamente em pacientes em estado grave. Dentre esses tratamentos, destacam-se:

  • Remdesivir - Análogo de adenosina com atividade antiviral contra vírus de RNA, que leva à terminação da cadeia do RNA viral nascente;

  • Lopinavir/Ritonavir - Inibidor de proteases, utilizado normalmente como antirretroviral para o tratamento do HIV;

  • IFNβ-Ia - Possui propriedades antiviral, antiproliferativa e imunomoduladora;

  • Cloroquina/Hidroxicloroquina - Possui atividade antiviral ao bloquear a infecção pelo aumento endossomal do pH requerido para a fusão vírus/célula, bem como interfere na glicosilação dos receptores celulares dos coronavírus.

Outros protocolos já foram também considerados e possuem grande potencial para o tratamento do SARS-CoV-2 como: Ribavirina, Anticorpos neutralizantes, RNA de interferência e CRISPR-Cas13d.
Paralelamente, na visão de alguns especialistas muitos dos protocolos propostos objetivam somente retardar a velocidade com que a doença avança entre as fases, pois, desta forma haverá uma maior possibilidade do doente controlar a evolução da infecção, reduzindo, em muitos casos, o tempo de internação, ao mesmo tempo em que aumenta a chance de sua recuperação. Desta forma, mesmo que não totalmente efetivos, estes tratamentos contribuiriam para compatibilizar a oferta de leitos em UTIs com a quantidade de doentes que necessitarão de internação nesta Unidade.

Contudo, a despeito destas iniciativas, do ponto de vista de um entendimento científico visando uma solução definitiva, o maior desafio reside na falta de um modelo experimental que seja útil para se avaliar a infecção causada por esse vírus. Na literatura já vimos que várias culturas celulares são permissivas ao SARS-CoV-2, como células Vero e células Huh-7. Mas qual seria o modelo experimental ideal para se pesquisar e estudar o SARS-CoV-2? Para responder a essa pergunta, é necessário voltarmos a discutir sobre os receptores do SARS-CoV-2. Sabemos que camundongos normais parecem ser resistentes à infecção pelo SARS-CoV-2. Possivelmente essa resistência ocorre devido a diferenças estruturais no receptor ACE2 de camundongos, quando comparado com as proteínas ACE2 humanas. Desta forma, o SARS-CoV-2 exibe um fraco tropismo para os tecidos de camundongos, se mostrando ineficiente para infectá-los. Uma opção seria a produção de camundongos transgênicos. Em 2007, o Dr. Paul McCray, da Universidade do Iowa, e seus colaboradores introduziram um vetor contendo uma sequência de ACE2 humano em camundongos selvagens, levando à produção de uma linhagem transgênica chamada de K18-hACE2, que expressava a ACE2 humana nas células epiteliais do trato respiratório de camundongos. Estudos posteriores mostraram que esses camundongos infectados com SARS-CoV pela via intranasal poderiam infectar essas células. Além disso, o SARS-CoV-2 também pode se ligar ao ACE2 desses camundongos, levando a danos nos pulmões, com pneumonia moderada, multifocal e intersticial, o que suporta o uso de modelos murinos transgênicos K18-hACE2 para pesquisa do SARS-CoV-2.

Outro modelo interessante é o de macacos Rhesus. A pesquisa do virologista chinês Chao Shan com estes animais mostrou que quando esses macacos são infectados com o SARS-CoV-2, ocorre a presença de doença leve, com perda de peso e sem desenvolvimento de febre, mas quando é realizado o raio X de seus pulmões, aparecem sinais de pneumonia similar aos sinais de pneumonia em humanos com SARS-CoV-2.

Um modelo experimental não convencional que tem se destacado em infecções respiratórias e que pode também ser utilizado para o estudo de infecções por SARS-CoV-2 é o que utiliza os furões (Mustela putorius). Pesquisadores da Coreia do Sul inocularam furões pela via intranasal com a cepa NMC-nCoV02 (isolada de um paciente com SARS-CoV-2 da Coreia do Sul). Além disso, animais não infectados foram deixados em contato direto (na mesma gaiola) ou indireto (separados por gaiolas com uma separação entre furões infectados e não infectados) com furões infectados dois dias após a infecção primária para avaliar a transmissão do vírus nesses animais. Os animais infectados e que tiveram contato direto com os animais infectados apresentaram febre e atividade reduzida, mas não apresentaram letalidade no período em que o experimento foi realizado. Além disso, os animais apresentaram o vírus no soro, lavado nasal, saliva, urina e fezes. Foi observada a replicação do vírus no nariz, traqueia, pulmão e intestinos dos animais quando infectados pelo SARS-CoV-2. Por fim, houve aumento do infiltrado imune e aparecimento de debris celulares na parede alveolar, epitélio e lumen branquial, o que pode evidenciar bronqueolite aguda. Esses resultados foram interessantes, pois demonstram a possibilidade da utilização dos furões como modelos experimentais para o SARS-CoV-2 e demonstra que esses animais apresentam transmissão do vírus por contato direto, o que lembra a transmissão humano-humano.

Além desses animais, outros modelos experimentais foram utilizados na infecção por outros coronavírus, como o SARS-CoV e o MERS-CoV o que pode tornar possível (a partir de futuros estudos com esses animais) sua utilização para novos estudos relacionados à infecção pelo SARS-CoV-2. Dentre esses modelos, podemos citar camundongos:

  • BALB-C - Ocorre doença respiratória em SARS-CoV após adaptação nesses hospedeiros por passagem seriada da cepa MA15, específica para o SARS-CoV;

  • C57BL/6 e 129s - Suportam a replicação do SARS-CoV nos pulmões e desenvolvem doença leve ou subclínica, mimetizando a doença leve que ocorre em humanos;

  • BLT-L - Camundongos imunodeficientes que tiveram tecidos humanos do pulmão implantados para criar camundongos humanizados somente no pulmão, sendo modelos experimentais tanto para o SARS-CoV quanto para o MERS-CoV.

Além de camundongos, outros animais também já foram utilizados para o estudo da infecção por diversos coronavírus humanos, tais como:

  • Hamster sírio - Ocorre replicação viral, aparecimento de infecção moderada do pulmão e a presença do vírus em outros órgãos;

  • Macaco verde Africano – Animais mais velhos apresentam resposta imune comprometida, como o que ocorre em humanos.

Independente da espécie animal utilizada na compreensão da doença e de seu uso visando a descoberta de uma terapêutica efetiva, uma outra estratégia de suma importância é o emprego de tecnologias de edição de DNA na produção de animais de laboratório mais apropriados à investigação da COVID-19. Para esta estratégia a espécie mais adequada é também a mais utilizada na pesquisa biomédica: o camundongo.
Atualmente, inúmeros centros produzem animais geneticamente modificados, e em razão da instalação de consórcios e de “redes colaborativas” internacionais com os objetivos de desenvolver; caracterizar fenotipicamente e estocar para distribuição, modelos animais obtidos com tecnologias de edição de DNA, a oferta deste animais crescerá ainda mais. Em um momento como este que estamos vivendo, o desenvolvimento de um camundongo capaz de por exemplo, ser susceptível à infecção de maneira similar aos humanos, poderá representar o ponto de inflexão para um tratamento eficiente e eficaz que poderá ser aplicado em larga escala mais rapidamente.

Diversos grupos de pesquisa então a procura de animais transgênicos já produzidos e que poderiam ajudar na investigação da COVID-19 até que um modelo mais apropriado esteja pronto. Nesta procura, um importante aliado é o International Mouse Strain Resource (IMSR: www.findmice.org), um banco de dados on-line pesquisável, onde a comunidade científica de todo o mundo tem à sua disposição linhagens de camundongos; estoques e linhagens de células armazenadas em diversos países. O principal objetivo do IMSR é ajudar a comunidade científica internacional a localizar e receber linhagens de camundongos mantidas nas instituições parceiras. O IMSR conta atualmente com bancos de germoplasmas e instituições parceiras instaladas no Japão; Canadá; Europa; Estados Unidos e Ásia entre outros, totalizando 26 Repositórios internacionais para consulta.
Como exemplo, em apenas uma destas bases, o EMMA (European Mouse Mutant Archive), uma “rede” formada por 16 parceiros, são mantidas em seus estoques mais de 6000 linhagens “doadas” e mais de 2500 linhagens desenvolvidas com o EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Program ); com o Knockout Mouse Project (KOPM) e também as geradas pelo International Knockout Mouse Consortium (IKMC). O EMMA é um repositório sem fins lucrativos voltado para a coleta, arquivamento (via criopreservação) e distribuição de linhagens de camundongos mutantes, transgênicas e Knockouts empregados na pesquisa biomédica.

Outro exemplo importante no entendimento da crescente oferta de novos modelos, foi a junção de duas iniciativas originalmente distintas, o International Knockout Mouse Consortium (IKMC) que se integrou ao International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC), possibilitando a duplicação de esforços na produção de animais transgênicos. Esta associação produz e caracteriza fenotipicamente, 20.000 genes de linhagens knockouts e há a ambiciosa proposta de juntos produzirem uma linhagem mutante para cada uma das proteínas conhecidas.

Todos estes esforços são essenciais neste momento e são também consequência de uma Ciência em Animais de Laboratório bem estabelecida e madura, que tem como principal objetivo criar as condições ideais para a existência de uma pesquisa biomédica Reprodutiva e Universalizada, respeitando, sobretudo, a ética na experimentação animal.
Por fim, voltando a falar sobre a pesquisa com um agente viral que se mostrou bastante agressivo, é importante frisar que antes de se começar a trabalhar com o SARS-CoV-2, é necessário que se leve em conta as recomendações do CDC (Centro de Controle de Doenças) Estadunidense. O CDC preconiza que o manuseio das amostras de pacientes infectados (como amostras do trato respiratório ou do sangue e seus constituintes) ou estudos e pesquisas envolvendo o RNA viral devam ser realizados em laboratórios de nível de biossegurança 2 (NB2). Mas, se as atividades envolverem altas concentrações do vírus, como grandes volumes de amostras infecciosas, propagação do vírus ou isolamento viral (que podem necessitar a utilização de modelos experimentais animais ou cultura de células), passa a ser necessário a utilização de locais que possuam nível de biossegurança 3 (NB3). Dessa forma, o uso dos modelos animais apresentados acima só deve ser realizado em locais com NB3, o que não é o encontrado em boa parte dos laboratórios e biotérios brasileiros.

Ainda não sabemos muito sobre a infecção causada pelo SARS-CoV-2 e o que ela poderá causar na que já está sendo considerada a primeira grande pandemia no século XXI. Em relação à utilização de animais de laboratório, no estudo da infecção causada pelo SARS-CoV-2, novas pesquisas são necessárias para se conhecer e padronizar novos modelos experimentais para o SARS-CoV-2, para o estudo das manifestações clínicas, patogênese viral e resposta imune relacionados à doença. Esses modelos são também extremamente importantes para se realizar avaliações pré-clínicas de vacinas, antivirais e tratamento da infecção pelo SARS-CoV-2. Acreditamos que, com o avanço das pesquisas científicas e atuação dos pesquisadores do Brasil e do mundo, poderemos vencer mais essa nova batalha que está nos deixando em casa.

Bibliografia consultada:

  • Brown AJ, et al. Broad spectrum antiviral remdesivir inhibits human endemic and zoonotic deltacoronaviruses with a highly divergent RNA dependent RNA polymerase.

  • Channappanavar et al. Dysregulated Type I Interferon and Inflammatory Monocyte-Macrophage Responses Cause Lethal Pneumonia in SARS-CoV-Infected Mice.

  • Clay CC, et al. Severe acute respiratory syndrome-coronavirus infection in aged nonhuman primates is associated with modulated pulmonary and systemic immune responses.

  • Dhama K, et al. COVID-19, an emerging coronavirus infection: advances and prospects in designing and developing vaccines, immunotherapeutics, and therapeutics.

  • Gretebeck LM, Animal models for SARS and MERS coronaviruses.

  • Kannan S, et al. COVID-19 (Novel Coronavirus 2019) - recent trends.

  • Kim YI, et al. Infection and Rapid Transmission of SARS-CoV-2 in Ferrets. Cell host & microbe 2020.

  • Kruse RL. Therapeutic strategies in an outbreak scenario to treat the novel coronavirus originating in Wuhan, China.

  • Li G, Fan Y, et al. Coronavirus infections and immune responses.

  • Lim J, et al. Case of the Index Patient Who Caused Tertiary Transmission of COVID-19 Infection in Korea: the Application of Lopinavir/Ritonavir for the Treatment of COVID-19 Infected Pneumonia Monitored by Quantitative RT-PCR.

  • McGruder B, A review of genetic methods and models for analysis of coronavirus-induced severe pneumonitis.

  • Menachery VD, et al. Combination Attenuation Offers Strategy for Live Attenuated Coronavirus Vaccines.

  • Momattin H, et al. Therapeutic options for Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV)--possible lessons from a systematic review of SARS-CoV therapy.

  • Nguyen TM, et al. Virus against virus: a potential treatment for 2019-nCov (SARS-CoV-2) and other RNA viruses.

  • Prompetchara E, et al. Immune responses in COVID-19 and potential vaccines: Lessons learned from SARS and MERS epidemic.

  • Qin C, et al. Dysregulation of immune response in patients with COVID-19 in Wuhan, China.

  • Roberts A, et al. A mouse-adapted SARS-coronavirus causes disease and mortality in BALB/c mice.

  • Shanmugaraj B, et al. Perspectives on monoclonal antibody therapy as potential therapeutic intervention for Coronavirus disease-19 (COVID-19).

  • Shen KL. Diagnosis and treatment of 2019 novel coronavirus infection in children: a pressing issue.

  • Tetro JA. Is COVID-19 receiving ADE from other coronaviruses?.

  • Tortorici MA, et al. Structural basis for human coronavirus attachment to sialic acid receptors.

  • Wahl A, et al. Precision mouse models with expanded tropism for human pathogens.

  • Wan Y, et al. Receptor Recognition by the Novel Coronavirus from Wuhan: an Analysis Based on Decade-Long Structural Studies of SARS Coronavirus.

  • Wang M, et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro.